光子臭氧用于真菌杀灭的观察

1．材料
    1.1 便携式交直流两用臭氧发生器(简称光子臭氧发生器)，属高新科技专利产品(专利号：89211425.8)。功率：4W／只，电压：220V或DC6V，容积5L(塑料袋)。
     1.2 真菌由自来水或大气自然污染中分离。
     1.3 小号玻璃培养皿，15只。
     1.4 Eagle培养液，日本产。

2．方法
     2.1 将小号玻璃培养皿用自来水洗涤后，打开皿盖，暴露于空气2-3小时(h)，再移入56℃衡温箱内干燥2-3h，然后分成对照及试验两组。
     2.2 试验组置于容积为5L的塑料袋内，同时放入功率为4w／只交流电光子0₃发生器，以>100mg／m3 03浓度，按不同时间进行灭菌。
     2.3 将平皿按有无作0₃杀菌来划分对照及试验两组，其他操作内容两组相同；分别按无菌操作加入真菌培养液，每皿3ml，置于37℃衡温箱内孵育足五天观察结果。
     2.4 培养液按配方制备后，分装小试管，每管3ml，再行121℃高温高压消毒15分钟，后置冰箱内备用。
     2.5 观察指标
         2.5.1 培养液是否混浊；
         2.5.2 培养液面有无菌落；
         2.5.3 培养液内有无絮状菌丝出现，以单个菌丝团为单元进行计数；
         2.5.4 以培养液清晰、液面无菌落、液内无菌丝为阴性，反之为阳性。
         2.5.5 对照组：包括培养液作空白对照；未经O₃杀菌的平皿作为阳性对照。
     2.6 灭菌率：对照组菌丝团数-试验组残存菌丝团数×100％对照组菌丝团数

3．结果

O3作用时间(h)	1	11月2日	2	3	4	6
样品总数(件)	2	3	3	4	6	4
阴性数(件)	1	0	1	2	4	2
阳性数(件)	1	3	2	2	2:02	0
阴阳比例(件)	1:01	0:03	1:02	2:02	4:02	4:00
转阴率(％)	50	0	33.3	50	66.7	100

     表1光子O₃对真菌作用时间与转阴率观察
注：从阴阳件数比例计算转阴率
    表 l 显示:当0₃作用1.3h，其转阴率未超过50%；当0₃作用4h，其转阴率上升到66.7%：当0₃作用6h，其转阴率达到100%。由此表明，随着O₃对真菌作用时间的延长，其转阴率也随即提高。
     表 2 对照组显示:如序号(2)、(3)，其菌量为9、10，及序号(4)，其菌量为190、210所示，平皿洗涤后，打开皿盖，暴露于空气与否，后置56℃衡温箱或室内干燥，其受污菌量则无明显差异。

4．讨论
     4.1 O₃对真菌的杀灭作用。按真菌培养要求，以一日24h连续培养5日(120h)未出现菌丝团为阴性。如表l所示，当O₃浓度>100mg／m³(即>0.1mg／L)，实验发现0₃能完全杀灭真菌，但0₃需持续作用4-6h。采用如此高浓度0₃才能杀灭真菌，也显示真菌的抵抗力非同一般，比细菌强得多，甚至比灭活乙肝病毒表面抗原(HBSAg)的0₃浓度(>60mg/m³/h)(1）还要高，时间长。0₃对真菌的杀灭时间竟需达数小时，这与真菌的结构有关，真菌的细胞壁厚而坚固，它由多糖和多糖蛋白复合物构成。大多数真菌胞壁的多糖是几丁质，它是一种含氮的多糖。据1936年有学者在密闭的容器内用环氧乙烷80mg/L杀灭面包店设备上的霉菌孢子，发现达到灭菌时间为16h；1946年又有学者以提高环氧乙烷浓度为160mg/l于密闭容器内，86℉下杀灭琼脂斜面上生长的真菌，3h达到灭菌(2)。众所周知．环氧乙烷穿透性强，杀菌率高，但毒性残留明显，难以用作食具消毒，更不可直接用于食品消毒。
     4.2 0₃杀灭真菌的机理探讨。0₃既是属于过氧化物类高效、快速、安全、无残留的洁净消毒剂，又是属于氧化还原电位高(2.07 ev)的强氧化剂。0₃能杀灭细菌、病毒、真菌、芽胞、原虫、包囊及虫卵等。它能氧化分解细菌的葡萄糖氧化酶、脱氢氧化酶，还可直接与细菌发生作用，导致细菌物质代谢氧化还原过程的破坏，使菌死亡。随着分子生物学的蓬勃发展，微生态学将生态扩展到分子水平。其实无论蛋白质或核酸分子均属有机物，它们都是由碳、氢、氧、氮及磷或硫(C、H、O、N、P或S)组成(3)同时，病毒的衣壳体是由许多蛋白质亚单位即壳微粒组成。蛋白质则由多链组成，核酸又由连在一起的。

项目	对照组			试验组						备注
菌量	阳性		空白	O3作用时间(h)
灭菌率％
青号	衡温箱	置室内	培养液	1	11月12日	2	3	4	6
1		12	(一)		1 88.9	(一) 100	(一) 100	(一) 100		用自来水洗涤平皿后，暴露于空气2-3h，再分对照和试验两组
2		9	(一)					(一) 100	(一) 100	自来水洗涤平皿后，暴露于空气2-3h，后置56℃衡温箱或置室内干燥，再分对照和试验两组
3	IO			-				90
4	190	210	(一)		5 97.5				(一) 100
5	200		1		2 98.5				100	自来水洗涤平皿后，暴露于空气2-3h，后置56℃衡温箱2-3h，再分对照和试验两组
6	42		(一)				9 78.6	1 97.6	(一) 100
7	8		（一）	（一） 100		4 50	1 87.5	(一) 100		自来水洗涤平皿后，直接置于56℃衡温箱2h，再分对照和试验两组
8	14		（一）	2 85.7		1 92.9	(一) 100	(一) 100

     表2 光子O₃对真菌杀灭观察
注：从灭菌量计算灭菌率
     核苷酸链组成。其中—OH，从整体看，它是电中性的(R-OH)，但从基团的内部看，它的一部分带有更多的负电荷(如氧原子)，因基团的这部分(R-OH)有“额外”的成键电子，所以带负电；另一部分带有更多的正电荷(如氢原子)，基团的这部分缺乏成键电子，所以带正电。若有另一个相似的基团靠近，正、负电荷之间互相吸引便生成一个弱键，即称氢键，如多肽的基团之间或核苷酸的硷基之间以及在DNA或RNA分子里的硷基配对均容易形成氢键。虽然单个氢键非常弱，但是很多氢键在一起，从而构成植物细胞坚韧的细胞壁。现再看0₃，它是属强氧化剂，氧化电位高，凡电负性高的元素能强烈地吸引电子、氧化对方，还原自己。氧化结果，导致核酸分解，蛋白质解体；抗原变性，检测转阴；代谢终止，菌体死亡。
     4.3 真菌在自然界的分布及其危害。本实验所述对照组显示，自来水或空气中均有大量真菌存在。有报道：(4)牙签、棉签也有真菌污染，牙签中总检出率高达47.5-70%；灭菌棉签中总检出率为12.5-23.3%。这与其它学者的报道：(5)“真菌在自然界分布极为广泛，无论是水、空气、土壤、还是动植物上，均有真菌的存在”基本相符。近年来的研究发现，有些植物寄生性真菌和腐生性真菌产生的毒素，对人和动物具有致病性。在消毒学上，对这类真菌及其毒素也应倍加重视。由于食物中含有丰富的营养物质，真菌污染食物的机会也特别多。大多数真菌在食物上的生长繁殖可造成食物的腐败变质，但一般不致病，少数真菌还可导致真菌病，在医学上有重要意义。因此，食物的微生物污染和食品的消毒灭菌是当今学者深为关注的课题。此外，在实验室的器材中，有不少是由塑料制品替代，如用于单克隆抗体制备的塑料板，不宜用高温高压作消毒灭菌，而先用酒精浸泡24h，随后再用紫外线照射数小时，还难免仍有细菌真菌污染。制备单克隆过程，一旦遭受污染，则会影响总体实验材料全功尽弃。在此情况下，若将塑料板采用高浓度03消毒灭菌，它既能缩短消毒时间(<6h)，减轻劳力，节约耗资，且可确保消毒灭菌高效快速。
     光子0₃制备原理与传统高压放电产生0₃不同(6)它不用高压电，不产生有毒有害的氮氧化物(NOX)致突试验阴性，其形成0₃的原理与高空臭氧层形成0₃的原理一致，但与雷电产生O，不同。光子O₃制备过程，是以空气为原料，采用光子技术产生特定光谱(<200 nm)激发空气中氧分子，经Oz的化学反应(离解聚合)形成高浓度0₃，体现就地取材(空气)一服务人类一回归自然，即0₃在常温下转化为氧回归自然，符合绿色环保、生态平衡和“可持续发展战略”要求。人们完全能自由地驾驭0₃为人类服务的时代已经到来。
     4.4 0₃用于食品、饮料消毒是一种理想选择。
     对真菌的培养检测用一般培养基不易检出，而需用特殊培养基并需连续培养五日才获结果。食品工业每年中秋月饼、西点巧克力及饮料果汁，在保质期内出现霉变现象时有所闻，当然其中因素很多，但与消毒措施是否匹配、检测要求是否到位不无关系。
     当今0₃已被广泛用于食品工业杀菌防霉。1997年美国食品与医药管理局(FDA)宣布放弃对食品加工使用0₃的限制政策，承认0₃应用于食品加工符合“通用安全标准”(GRAS)要求(7)，由此确定了0₃在食品加工业的新兴消毒剂地位，这一声明也成了O₃技术发展的里程碑。传统的食品消毒杀菌方法已显然不能满足越来越高的卫生标准。实践证明，利用O₃杀菌谱广、灭菌力强、消毒效果好、且无残留，没有二次污染的特性，有助于打破国际贸易中对农副产品的技术壁垒，保持农副产品在国际市场的竞争优势，具有现实和深远的意义。
     0₃的功能有：消毒灭菌；防霉保鲜；解毒净化；除臭脱色；洁水增氧；氧化防污；医疗保健。臭氧被誉称为少有的可直接对食品使用的“洁净消毒剂”。0₃对人的健康有无影响，国内外学者极为关注，研究甚多。从环境流行病学资料，没有发现暴露于0₃等氧化剂与肺癌危险性之间有任何关系，动物实验中亦没得到致癌证据(8)。1995年报道：动物持续长期的吸入0₃试验，显示0₃不致癌，0₃是迄今为止人类可利用的最强氧化剂。强氧化性灭菌消毒是世界卫生消毒技术的发展方向。

参考资料：
     (1) “臭氧用于HBSAg的灭活”王芳《消毒与灭菌》6(3)P145，1989。
     (2) “环氧乙烷杀真菌作用”薛广波《实用消毒学》P.279人民军医出版社1986。
     (3) “臭氧在微生态研究中的应用”陈君胜等《动物微生态研究进展》P.123中国农业大学出版社，2000。
     (4) "牙签、棉签也有污染”，姚齐龙《大众医学》4(上半月)2003。
     (5) “真菌”薛广波《实用消毒学》P54,P60同上。
     (6) “臭氧开发应用作为‘可持续发展战略’实施的内涵之一”，陈君胜等《中国现代医学论坛》大型系列丛书1999。
     (7) “美国臭氧技术发展动态”Rip G．Rice((Ozone Science&Engineering))21(2)1999摘自《国外臭氧技术资料选译》(1)臭氧技术信息服务网编印P.1—10 1999。
     (8) 《环境医学》P46王绍汉等，天津科学技术出版社1987。